植物组织培养(一)

1、植物组织培养（ plant tissue culture ）：在无菌和人工控制的环境条件下，利用适当的培养基，对离体的植物器官、组织、细胞及原生质体进行培养，使其再生细胞或完整植株的技术。又称植物离体培养

2、外植体（explants）：植物组织培养中，使用的各种器官、组织和细胞。或从活植物体上获得的可以用于组织培养的器官、组织和细胞。

3、愈伤组织（callus）：外植体因受伤或在离体培养时，其未分化的细胞和已分化的细胞进行活跃的分裂增殖而形成的一种无特定结构和功能的组织。

5、继代培养（subculture）：将初代培养得到的培养体移植于新鲜培养基中，这种反复多次移植的培养。

1、整个过程是无菌操作；2、培养条件可人为控制，便于进行周年培养、研究和生产； 3、生长周期短，繁殖率高；4、管理方便，利于工厂化生产和自动化控制。

1组织培养：分生组织、形成层组织、薄壁组织、韧皮部组织等。2器官培养：根、茎、叶、花、果实、种子等。

植物组织培养的理论基础是1838-1839年德国植物学家Schleidon和动物学家Schwann提出的细胞学说：一切生物都是由细胞构成的，细部是生物体的基本功能单位，细胞只能由细胞分裂而来。

1、探索阶段（1902-1929年） 2、组培方法和定义的建立阶段（1930-1939年） 3、细胞全能性的证实阶段（1940-1959） 4、组培技术和理论迅速发展阶段（1960-1979） 5、组培技术的广泛应用阶段（1980-今）

1、组织培养理论、实践、技术和方法日趋成熟，已形成独具特色的专业技术；

2、组织培养已广泛应用于生物学的许多分支学科，有力地推动了生物科学中植物生理学、生物化学、遗传学、细胞学、形态学以及农、林、医、药等各门学科的发展和相互渗透，3、促进了营养生理、细胞生理和代谢、生物合成、基因转移、基因重组的研究。

4、组织培养已成为生物工程的一项重要技术，在基础理论研究和生产实践中发挥的作用与日俱增，可望为造福人类作出较大贡献。

1、花药培养；2、体细胞无性系变异；3、植物快速繁殖技术；4、体细胞胚胎发生和人工种子；5、组织细胞培养物的超低温保存及种质库的建立

1、植物离体快繁优点：繁殖系数大，速度快，苗木整齐一致，周年生产.2、无病毒苗木培育优点：生长势强，整齐一致，产量增加。3、培育新品种/物种

(1)培育远缘杂种原生质体融合克服杂交不亲和性，早期胚离体培养克服胚败育

1、用途：（1）器具的清洗、干燥、保存（2）培养基的配制、灭菌（3）蒸馏水的生产（4）常规的生化分析

2、主要仪器设备：工作台、药品柜、洗刷池、干燥箱、培养箱、冰箱、便携式高压灭菌锅、立式高压灭菌锅、卧式高压灭菌锅、天平、酸度计、电磁炉、电炉、照相机、玻璃器皿

1、用途：植物材料的消毒、接种、培养物的继代及细胞融合。

2、主要用具和设备：缓冲间（安装紫外灯）、超净工作台（水平式）、超净工作台（垂直式）、接种用具、运送车、枪状镊子、显微镜、体视镜

（1）房间干爽安静，清洁明亮，墙壁光滑平整不易积污灰尘，地面平坦无缝便于清洗和灭菌；

（2）定期消毒：室内安装紫外灯接种前开灯20min，或定期用甲醛与高锰酸钾产生的蒸汽薰蒸；

1、用途：将接种到培养瓶等器皿中的植物材料进行培养的场所。

2、要求：（1）温度范围：20-30℃，一般25℃；（2）相对湿度：70%-80%；（3）光照范围：1000-6000lx；（4）光照时间：每天光照10-16h。

3、主要设备：培养架（三角铁，装日光灯）、培养架（木材，装日光灯）、恒温振荡器、照度计、光照定时器、空调、普通振荡器、

4、重铬酸钾：铬离子污染环境，有时用于吸管、移液管洗涤。

6、新购置的玻璃器皿洗涤：多带有碱性物质，先用1%稀盐酸浸泡一夜。

1、干热灭菌法：用于玻璃器皿或器具，恒温干燥箱中150℃，保温2h；

2、高压蒸汽灭菌法：用于玻璃器皿、器具和培养基，121℃保持20-30min。

3、过滤除菌法：用于高温下容易分解或变性的物质，如生长调节物质、酶等。此法比较麻烦，不常用。

1、实验前30min打开紫外灯，工作时关闭；2、用酒精棉（浸泡70%酒精）擦拭工作台；3、手和小臂用70%酒精消毒；4、培养瓶的瓶口在酒精灯上烧烤灭菌；5、镊子、解剖刀等用具浸泡在90%或95%酒精中，在酒精灯上烧烤灭菌，后放支架上待用。

第三节培养基

培养基是植物组织培养的核心，它提供植物生长所需的营养物质，是决定植物组织培养成败的关键因素之一。外植体之所以能沿着不同的组培途径生长、分化，其主要原因就在于培养基中的物质成分对细胞的生长发育起着定向调控作用。

在离体培养条件下，不同种植物的组织对营养有不同的要求，甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同。因此，在建立一项新的培养系统时，首先必须找到一种合适的培养基，培养才有可能成功。

培养基的产生最早是Sacks(1680)和Knop(1681)，他们对绿色植物的成分进行了分析研究，根据植物从土中主要是吸收无机盐营养，设计出了由无机盐组成的Sacks和Knop溶液，至今仍在作为基本的无机盐培养基得到广泛应用。以后根据不同目的进行改良产生了多种培养基。

培养基的名称，一直根据沿用的习惯。多数以发明人的名字来命名，如White培养基，Murashige和Skoog培养基(简称MS培养基)，也有对某些成分进行改良称作改良培养基。

一、培养基的构成：

1、水分

2、无机盐类：大量元素、微量元素

3、有机营养成分：糖类物质（蔗糖,葡萄糖,果糖,麦芽糖）、维生素类、氨基酸类

4、植物生长调节剂：生长素（IAA,NAA,2,4-D,IBA.抑制芽）、细胞分裂素(6-BA,ZT,KT.促进芽分化)

5、天然有机添加物：椰子汁，香蕉泥，番茄汁，胶木提取液等

6、pH值：常用5.8，过高培养基变硬，过低培养基不凝固

7、凝固剂：常用琼脂（粉），7-10g/L

8、其他添加物：活性炭

活性炭的特性：

木炭粉碎经加工形成的粉沫结构，结构疏松，孔隙大，吸水力强，有很强的吸附作用，它的颗粒大小决定着吸附能力、粒度越小，吸附能力越大。温度低吸附力强，温度高吸附力减弱，甚至解吸附。通常使用浓度为0.5—l0g／L。它可以吸附非极性物质和色素等大分子物质，包括琼脂中所含的杂质，培养物分泌的酚、醌类物质以及蔗糖在高压消毒时产生的5—羟甲基糖醛及激素等。

活性炭的作用：

1、可减少组织变褐和培养基变色，可以吸附外植体产生的致死性褐化物；

2、降低玻璃苗的产生频率，对防止产生玻璃苗有良好作用。

3、对生根有明显的促进作用，其机理一般认为与活性炭减弱光照有关，可能是由于根顶端产生促进根生长的IAA，但IAA易受可见光的光氧化而破坏，因此活性炭的主要作用就在于通过减弱光照保护了IAA，从而间接促进了根的生长，由于根的生长加快，吸收能力增强，反过来又促进茎、叶的生长。

4、活性炭的副作用：活性炭能吸附生长调节物质，大量的活性炭会削弱琼脂的凝固能力，因此要多加一些琼脂。总之，把活性炭任意量放人培养基，会带来不良的后果。因此，在使用时要有其量的意识，使活性炭发挥其积极作用。

二、培养基的类型

1、硝酸钾含量高的培养基如：MS，LS，BL，BM，ER

2、中等无机盐含量培养基如: B5，N6，SH

3、低无机盐含量培养基如: H，Nitsch，Miller。大量元素是MS培养基的一半。

4、高盐成分培养基如: White，WS，HB。无机盐是MS培养基的1/4，有机成分也很低。

三、培养基母液的配制

大量元素（合并配制）；微量元素（合并配制）；钙盐（氯化钙）；铁盐（螯合铁）；有机成分（分别配制）；生长调节剂（分别配制）。

四、培养基的配制

琼脂；蔗糖；按顺序取母液到烧杯中；容量瓶定容调pH值；分装，封口；灭菌（20min）。

铁盐配制方法：在装有400ml 蒸馏水的烧杯中加入2粒氢氧化钠（苛性钠），溶解后加入3.73g EDTA-Na2，加热使其全部溶解，然后边搅拌边慢慢加入2.78g FeSO4.7H2O直至全部溶解，冷却后定容至500ml，置于冰箱中备用。

母液配制时应注意的一些问题：

①一些离子之间易发生沉淀，如Ca2 和S042-，Ca2 、Mg2 和PO43- 一起混合后，会产生沉淀，一定要充分溶解再按一定顺序放入母液中。

②用蒸馏水或重蒸馏水配制；药品应选取等级较高的化学纯或分析纯；药品的称量及定容都要准确；先以少量水让其充分溶解，然后依次混合。

③母液配好后放人冰箱内低温保存（4℃），用时再按比例稀释。

④贮备液使用前摇动瓶子，如有沉淀、絮状物、微生物污染应停止使用。

母液和培养基配制的基本操作

1、大量元素

浓度大于0.5mmol/L ；包括Ｎ、Ｐ、Ｋ、Ｃa、Ｍg、Ｓ等元素；

培养基中的供给状态：

Ｎ：一般以硝态氮为主，配合一定量的氨态氮

Ｐ：以ＰＯ43-形式供给

Ｋ：以K 形式供给

Ca、Mg：以Ca2 、 Mg2 形式供给

S：以SO42-形式供给

MS 大量元素：KNO3 、NH4NO3 、KH2PO4 、MgSO4 ?7H2O 、CaCl2﹒2H2O、

2、微量元素

浓度小于0.5mmol/L ；包括Fe 、 Cu 、 Mo 、Zn、 Na 、Mn 、Co 、B、I等元素

培养基中的供给状态：

Fe：以螯合铁形式提供（即FeSO4?H2O和Na2-EDTA的螯合物）

其它元素：均以无机盐形式提供

MS 微量元素：KI 、H3BO3 、MnSO4 ?4H2O 、ZnSO4 ?7H2O 、NaMoO4 ?2H2O 、CuSO4 ?5H2O 、CoCl2 ?6H2O 、

MS 铁盐：FeSO4 ?7H2O 、Na2 ?EDTA

3、维生素：VC：防止组织褐化；VB1：与愈伤组织的产生和生活力有关；VB6：促进根的生长；烟酸：促进胚的发育；肌醇：利于胚和芽的形成

4、氨基酸：甘氨酸、丝氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、水解酪蛋白(CH) 、水解乳蛋白(LH)

5、常用的生长素类调节剂：NAA（萘乙酸）、IAA（吲哚乙酸）、IBA（吲哚丁酸）、2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）

NAA的作用

A：NAA 0mg/L，芽（少），根（无）

B：NAA 0.1mg/L，芽（少），根（无），愈伤组织（少量）

C：NAA 5.0mg/L，芽（少），根（多），愈伤组织（一定量）

6、常用的细胞分裂素类调节剂：BA（6-苄基氨基嘌呤）、KT（激动素）、ZT（玉米素）、Zip（z-异戊烯腺嘌呤）

BA的作用

A：BA 0mg/L ，芽(减少)，根(增多)，愈伤组织(一定量)

B：BA 0.1mg/L，芽(适量)，根(适量)，愈伤组织(一定量)

第四节离体培养体系的建立

一、供体植物材料；二、外植体的选择；三、外植体的处理；四、外植体的接种；五、外植体的成苗途径；六、培

养条件；七、污染的原因和预防措施；八、外植体的褐变和预防措施；九、培养物的玻璃化现象和预防措施。

一、供体植物材料：※ 田间材料※ 温室材料※ 无菌发芽材料

二、外植体的选择

1、选择原则：（1）再生能力强（2）遗传稳定性好（3）外植体来源丰富，便于重复实验（4）外植体灭菌容易

2、常用的外植体：茎尖，节间，叶片，叶柄，鳞片，种子，块根，块茎，花粉，花瓣等。

（1）茎尖：园艺植物组织培养中应用最多，繁殖率高，不易发生遗传变异，但取材有限；

（2）茎段：采用嫩茎的切段促进腋芽萌发，取材容易；

（3）叶：幼嫩叶片组织通过愈伤组织或不定芽分化产生植株，取材容易，操作方便，但易发生变异；（4）幼胚：培养愈伤组织比较容易。

三、外植体的处理

1、预处理：对外植体进行修整，去掉不要的部分，在流水下冲洗干净。

2、表面灭菌：充分灭菌，但不伤外植体；不同的外植体，灭菌的要求也不一样。

3、常用灭菌药剂的使用和效果

消毒剂	使用浓度/%	清除难易	消毒时/min	灭菌效果
次氯酸钠	2	易	5-30	很好
次氯酸钙	9-10	易	5-30	很好
漂白粉	饱和溶液	易	5-30	很好
升汞	0.1-1	较难	2-10	最好
酒精	70-75	易	0.2-2	好
过氧化氢	10-12	最易	5-15	好
溴水	1-2	易	2-10	很好
硝酸银	1	较难	5-30	好
抗菌素	4-50mg/L	中	30-60	较好

4、常用的灭菌方法

(1)茎尖、茎段及叶片等的消毒：

用清洁剂清洗---75%酒精浸泡10-20min---无菌水洗2-3次；

NaClO或氯化汞(升汞)溶液泡10-15min---无菌水洗3-4次；

（2）果实和种子的消毒：自来水冲洗10-30min---70%酒精漂洗---2%NaClO液浸10min---无菌水2-3次---取出种子培养;

（3）根及地下部器官的消毒：自来水冲洗---纯酒精漂洗---升汞浸5-10min或2%NaClO液浸10-15min---无菌水洗3次；

（4）花药的消毒：自来水冲洗 70%酒精浸泡数秒钟---无菌水洗2-3次---漂白粉上清液浸10min---无菌水洗2-3次。

5、消毒注意事项

1)、表面消毒剂对植物组织是有害的，应正确选择消毒剂的浓度和处理时间，以减少组织的死亡。

2)、在表面消毒后，必须用无菌水漂洗材料3次以上以除去残留杀菌剂，但若用酒精消毒，则不必漂洗。

3)、与消毒剂接触过的切面在转移到无菌基质前需将其切除，因为消毒剂会阻碍植物细胞对基质中营养物质的吸收。

4)、若外植体污染严重则应先用流水漂洗1小时以上或先种子培养得到无菌种苗，然后用其各个部分建立组织培养。

5)、HgCl2效果最好，但对人的危害最大，用后要用水冲洗至少5次。

四、外植体的接种

外植体的接种：是将表面灭菌的植物材料切碎或分离出器官、组织、细胞，转放到无菌培养基上的全部过程。整过接种过程均需无菌操作。

外植体接种过程

酒精擦手；外植体消毒；浸泡数分钟；器械消毒；酒精灯灼烧；酒精擦拭培养皿；酒精擦拭；旋转灼烧；取外植体；修剪外植体；接种；盖好瓶塞；

五、外植体的成苗途径

1、愈伤组织途径：外植体嘤俗橹芽、根嗍怨苊纾煌庵蔡遴愈伤组织嘌苦根嗍怨苊纾煌庵蔡遴愈伤组织喔芽嗍怨苊?/P>

2、胚胎发育途径：外植体嗯咦刺遴试管苗

3、直接成苗途径（如茎尖培养）：外植体喔⒀苦试管苗

在植物组织组织培养中，诱导胚状体与诱导芽相比较，有3个显著优点：

①数量多。一个外植体上诱导产生胚状体的数量，往往要比诱导芽的数量高得多；

②二是速度快。胚状体是以单细胞直接分化成小植株的，它比经过愈伤组织再分化成完整植株要快些；

③三是结构完整，成苗率高。

所以在育种工作及园艺工作中，可用胚状体作为优良基因型个体的无性繁殖手段。

六、培养条件

1、温度：不高于35℃，不低于 15℃，一般为25℃?℃，与植物的生长环境有关；

2、光照：光照强度，光照周期，有时需要暗培养；

3、湿度：培养瓶湿度100%，培养室70%-80% ；

4、培养基的营养物质和pH值：随着培养物的生长，培养基所含的营养物质随之降低，生长速度变慢；当大量的金属离子被吸收后,pH值将下降，影响培养物的生长。因此,培养基要及时更新；

5、培养物的气体环境：保持空气正常流通，既可以保持足够的氧气，又可及时排除培养物产生的二氧化碳等气体。因此，接种在固体培养基上时，培养物不要埋入过深，用液体培养基时，最好采用振荡方法。

如：种子和分生组织：培养时通常将其贴放在培养基表面，而不是插到培养基内部，以免供氧不足。

七、污染的原因和预防措施

污染：植物组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。

细菌污染（菌斑粘液状,1-3天出现）；真菌污染（不同颜色的霉菌,3天后出现）

1、污染的原因： → 空气中病原菌污染（细菌、真菌）→ 外植体、培养基、培养器皿带菌 → 操作人员未遵守操作规程

2、污染的预防措施：→ 防止材料带菌（外植体彻底消毒，培养基灭菌时要排净灭菌锅内冷空气等） → 防止用具带菌 → 接种室要处于无菌状态 → 培养物污染后应及时淘汰并作高压灭菌处理→ 操作人员要按照操作程序进行

防止操作带来的污染

A、整个接种操作应在近火焰处进行，且动作要迅速

B、接种过程中尽可能达到悬空要求

C、接种时不得用手接触瓶盖内壁或瓶口

D、瓶盖朝上放，接种完毕后立即盖好瓶口

八、外植体的褐变和预防措施

褐变：指外植体在培养过程中体内的多酚氧化酶被激后活，使细胞内的酚类物质氧化成棕褐色醌类物质，这种致死性的褐化物不但向外扩散致使培养基逐渐变成褐色，而且还会抑制其它酶的活性，严重影响外植体的脱分化和器官分化，最后变褐而死亡的现象。

1、影响褐变的因素

（1）植物种类：一般木本植物，单宁、色素含量高的植物易发生褐变。

（2）基因型：

（3）外植体的生理状态：一般幼龄材料，幼嫩器官和组织，春季取外植体，褐变发生较轻。外植体越老化，木质素含量越高，越易褐化。

（4）外植体损伤：外植体切口越大，酚类物质的被氧化面越大，褐化程度越严重。

（5）培养基的成分：培养基中无机盐浓度和细胞分裂素浓度过高，易导致褐化。如6-BA或 KT能促进褐变发生，而生长素类如IAA可减轻褐变发生。

（6）材料转移时间：

2、预防褐变的措施

（1）选择适宜的外植体及最佳培养基：适当降低培养基无机盐浓度，降低pH值，降低细胞分裂素水平等，可显著减轻培养物褐变；（2）连续转移；（3）加抗氧化剂：如硫代硫酸钠、抗坏血酸（4）加活性碳；（5）加多胺类物质：如精胺、亚精胺。

九、培养物的玻璃化现象和预防措施

玻璃化现象：培养物增殖培养时，若细胞分裂素浓度过高或细胞分裂素与生长素相对含量高，培养基中离子种类比例不适，琼脂和蔗糖浓度过低，不良培养环境如温度过高，光照时间不足及通气不良，易造成组培苗含水量高，茎叶透明，出现畸形的现象。

玻璃化现象的预防措施

1、适当控制培养基中无机盐浓度（氮浓度尤其铵态氮浓度不能过高）

2、适当控制培养基中蔗糖和琼脂浓度

3、适当降低细胞分裂素和赤霉素浓度

4、增加自然光照，控制光照时间

5、控制好温度

6、改善培养皿的气体交换状况

7、在培养基中添加其他物质

思考题

1、一个正规的组织培养实验室应具备那些房间？

2、组织培养的常用设备有哪些？各有何用途？

3、常用培养基的特点？

4、配制培养基的基本程序？

5、如何避免培养物污染？

第三章植物组织培养的基本原理

第一节植物细胞全能性和细胞分化

一、植物细胞全能性

全能性的提出：1902年，Haberlandt（德国植物生理学家）提出了植物细胞的全能性（totipotent)理论：植物细胞具有该植物体全部遗传特性的可能性，在适当条件下具有发育成完整植物体的潜在能力。

全能性的原理：植物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质，都有发育成为完整个体所必需的全部基因，从理论上讲，植物体的每一个活细胞都应该具有全能性。

细胞全能性的差异：（1）受精卵的全能性最高。（2）受精卵分化后的细胞中，体细胞的全能性比生殖细胞的低。

离体培养实现全能性的原因：处于离体状态的植物活细胞，在一定的营养物质、激素和其他外界条件的作用下，就可能诱导基因表达，从而表现出全能性，发育成完整的植株。人工条件下实现的这一过程，就是植物组织培养。

二、植物细胞分化

1、分化（differentiation）的概念

植物体各个部分出现异质性的现象。可以在细胞水平、组织水平、器官水平上表现出来，如细胞分化、组织分化，花芽、叶芽、茎和根等器官分化。

2、细胞分化是组织培养的关键

细胞分化是组织分化、器官分化的基础，是发育生物学的一个核心问题，也是离体培养再分化和植株再生得以实现的基础。

细胞分化的实质：基因选择性活化或阻遏。基因的活化或阻遏使细胞在结构、生理生化特性上发生改变，从而导致细胞分化。

例如：一个成熟已分化的细胞中，一般仅有5%-10%的基因处于活化状态。

细胞分化的基本问题：是一个具有全能性的细胞是通过什么方式使大部分遗传信息不再表达，而仅有少部分特定基因活化，最终表现细胞的特定功能。目前还不太清楚。

利用离体培养技术揭示的细胞分化规律

1、细胞分化分为形态结构分化和生理生化分化两类。生理生化分化要早于形态结构分化；

2、发育中的植物不存在部分基因永久关闭的情况；

3、在完整植株中，细胞发育的途径一旦“决定”，通常不易改变，但离体培养可以通过脱分化而改变这种“决定”；

4、极性与分化关系密切,极性一旦建立，常难以逆转；（极性：是植物分化的一个基本现象，是指植物的器官、组织甚至单个细胞中，在不同轴向上存在的某种形态结构和生理生化上的梯度差异。）

5、生理隔离或机械隔离在细胞分化中有促进作用；

6、细胞分裂对细胞分化具有重要作用，特定环境的细胞分裂可以导致特定的细胞分化；

7、细胞分化中常看到染色体多次复制而细胞不分裂所形成的核内多倍体和多线染色体。

8、植物生长调节剂在细胞分化中有明显的调节作用，它与细胞分化中的细胞生长、细胞分裂密切相关。如根或芽的分化取决于生长素与细胞分裂素的比值；

激素配比模式

为了促进芽器官的分化，应除去或降低生长素的浓度，或者调整培养基中生长素与细胞分裂素的比例。

高-----有利于根的形成

生长素/细胞分裂素适中--有利于无结构方式生长或根芽的同步分化

低-----有利于芽的形成

第二节离体条件下植物器官的发生

一、脱分化

1、脱分化（dedifferentiation，去分化）

指离体培养条件下生长的细胞、组织或器官，经过细胞分裂或不分裂，逐渐失去原来的结构和功能而恢复分生状态，形成物组织结构的细胞团或愈伤组织或成为未分化细胞特性的细胞的过程。

大多数离体培养物的细胞脱分化需经过细胞分裂形成细胞团或愈伤组织。

脱分化是分化的逆过程，其机理还不清楚。

2、影响脱分化的因素

（1）损伤；损伤刺激外植体细胞内发生一系列生理生化变化，使细胞增殖，这可能是生命的自我调节；

（2）生长调节剂；主要是生长素类有利于细胞增殖；

（3）细胞位置；外植体本身不同类型的细胞对培养条件的刺激敏感度不同；

（4）植物种类；植物不同，脱分化难易程度不同，一般双子叶植物比单子叶植物、裸子植物容易；

（5）外植体生理状态；不同季节、不同生理年龄，有不同的培养反应；

（6）光照；弱光或黑暗有利于脱分化中的细胞分裂。

二、愈伤组织培养

1、愈伤组织（callus）的形成过程

在脱分化过程中，大多数情况下首先形成愈伤组织。从脱分化到愈伤组织形成大致分为3个时期：

（1）诱导期：是愈伤组织形成的起点，细胞准备进行分裂的时期。

一般植物组织都能诱发愈伤组织。诱导愈伤组织的成败关键主要不是实验材料，而是培养条件，其中激素的成分和浓度是最重要的因素。

诱导期的特点：

细胞内的代谢被活化了，合成代谢迅速进行，但细胞的大小仍然和外植体时一样，没有多大改变。

诱导期的长短，由一系列内部（植物的种类、生理状况）和外部（光照、外源激素）因素决定。

例如菊芋的诱导期有时还不需要1天，胡萝卜则要好几天，而菊芋块茎贮藏时间的改变，诱导期也发生改变。从11月到次年4月取菊芋块茎进行培养，则诱导期从22小时逐渐延长到40小时。

（2）分裂期

在外源激素的作用下，外植体的外层细胞开始分裂（中间细胞不分裂），其细胞体积变小、数目增加，细胞核和核仁增到最大，逐渐恢复到分生组织状态，细胞进行脱分化，开始形成愈伤组织。

如果仍在原培养基上培养，细胞将不可避免地要发生分化，产生新的结构，而将其转移到新鲜培养基上，将维持其不分化的状态。

愈伤组织的特征：细胞分裂快，结构疏散，缺少有组织的结构，颜色浅而透明。

（3）分化期

停止分裂的细胞发生生理代谢变化，形成由不同形态和功能的细胞组成的愈伤组织。

愈伤组织的特点：

生长旺盛的愈伤组织一般呈乳黄色或白色，有光泽；也有浅绿色或绿色；而老化的愈伤组织多转变为黄色甚至褐色。

需要说明的是：

1、根据形态变化列出三个时期，实际上它们并不是截然分开的，特别是分裂期和分化期。一块愈伤组织的细胞既有处于分裂时期的、又有处于分化时期的。

2、理论上愈伤组织是可以无限制继代的，但随着继代次数的增加，形态发生的能力将逐渐丧失。

2、愈伤组织的类型

（1）Ⅰ型：结构紧密、坚硬，不易分开，表面有条状突起，这种愈伤组织常通过器官发生途径分化芽和根，产生的胚状体较少，不易继代培养；

（2）Ⅱ型：介于Ⅰ型和Ⅲ型之间，结构松散、易碎，有明显的颗粒状，白色或淡黄色，具有分化胚状体的能力，且能长期继代培养，是理想的愈伤组织类型------胚性愈伤组织。

（3）Ⅲ型：结构松软，水渍状，白色透明或半透明，很容易继代培养，但丧失了分化能力。

三、再分化

1、再分化（redifferentiation）：由脱分化状态重新进行分化的过程。

（1）细胞水平的再分化：细胞壁变厚、酶水平的变化、细胞机能分化等；（2）组织水平的再分化：常见的是微管组织的分化；（3）器官水平的再分化：又称器官发生；（4）植株再生：植株再生的方式有3种：①先长芽，其基部长根；②先形成根，根上再生芽；③愈伤组织的不同部位分别形成芽和根，然后形成微管组织把二者结合起来。

植株再生的途径：器官发生途径、胚胎发生途径

2、影响再分化的因素

（1）植物类型；不同植物再分化的能力有很大差异；

（2）基因型；同一植物不同基因型再分化能力有很大差异；

（3）培养条件；不同植物要求的植株再生条件可能不同；

（4）外植体；同一植物不同的外植体种类，再分化能力也有差异；同一外植体的大小不同，再分化能力也有差异；

（5）培养时间；愈伤组织培养时间过长或继代次数太多，再分化能力下降。

3、长期培养物形态发生潜力丧失的原因

有些愈伤组织或悬浮培养物起初具有器官发生或胚胎发生的潜力，但经过反复继代保存之后，其形态发生能力常常逐渐下降，有些甚至完全丧失。

解释这种现象有三种假说。

（1）遗传说

该假说认为，形态发生潜力的丧失是由于在培养细胞中的核的特性发生了改变，即细胞核内的遗传物质在培养继代过程中由于变异等原因而发生了改变或是突变，导致形态不能发生。

可以推知，由这种原因所造成的形态发生潜力的丧失是不可逆的。

（2）生理说

该假说认为，随着培养继代的反复进行，被培养的组织或细胞中的内源激素平衡关系可能会发生改变，从而导致形态不能发生。

在这种情况下，细胞虽然停止了器官和胚胎的分化，但并不一定就丧失了这种分化能力。因而，在这种情况下，如果改变外部处理条件，应该有可能使细胞的这种内在潜力得到恢复。

（3）竞争说

在复杂的多细胞外植体中，只有少数细胞能够产生胚性细胞团，其余细胞都无法表达其全能性，如果非胚性的细胞类型在培养基中具有生长上的选择优势，在反复的继代培养中，非胚性细胞的群体将会逐步增大，而胚性细胞则逐渐减少，到了一定时期之后，在培养物中已不再含有任何胚性细胞，这时若想再恢复它们的胚胎发生能力就不可能了。然而，如果在培养物中存在少量胚性细胞，只是由于处在支配地位的非胚性细胞的抑制作用下，致使这些胚性细胞的全能性无法表达，在这种情况下，通过改变培养基成分，使之有选择地促进全能细胞的增殖，就应当有可能恢复该培养物的形态发生潜力。

竞争说的倡议者Smith 和Street（1974）认为，在他们进行的胡萝卜细胞长期继代培养期间，有两个过程可能与胚胎发生能力的下降以至最终丧失有关：一是细胞对于生长素（2，4-D）抑制全能性表达的作用变得比较敏感；其次，随着时间的推移，由于培养细胞在细胞学上的不稳定性，出现了缺乏胚性潜力的新的细胞系，这些细胞学上的变化不一定是染色体数目的变化，而可能只是遗传信息的小的突变、丢失或易位。

竞争说本质上是遗传说和生理说的结合。

第三节植物体细胞胚胎发生

一、胚状体的概念正常的植物胚胎发生过程：受精后的合子（受精卵）到成熟胚的发生、发育的有规律变化形成合子胚（embryo）。

胚状体（embroid）：在离体培养条件下，细胞、组织和器官产生的类似胚的结构。成熟的胚状体可以象合子一样长出根和芽，萌发再生植株。体细胞胚胎发生：植物离体培养细胞产生胚状体的过程。

胚状体的优点：

（1）胚状体产生数量比不定芽多；（2）结构完整，胚状体一旦形成，即可长成小植株，成苗率高。（3）胚状体的有性后代遗传性更接近母体植株。（4）胚状体可制成人工种子，便于运输和保存；

这些对组织培养应用于育种都是十分重要的。

胚状体与不定芽的区别

①最根本的特征是具有两极性，即在发育的早期阶段，从其方向相反的两端分化出茎端和根端，而不定芽或不定根都为单向极性。

②胚状体的维管组织与外植体的维管组织无解剖结构上的联系，而不定芽或不定根往往总是与愈伤组织的维管组织相联系。

③胚状体的维管组织的分布是独立的“v”字形，而不定芽的维管组织无此现象

植物组织培养(一)