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植物组织培养(二)

二、植物茎段培养

1、植物茎段培养:对植物的带有一个以上定芽或不定芽的外植体(包括块茎、球茎、鳞茎在内的幼茎切段)进行离体培养的技术。

2、茎段培养的目的:茎段用于植物离体快繁;获得突变体;理论基础研究。

3、茎段培养过程

表面消毒的茎段

切成几厘米长带节的节段

接种到固体培养基

直接发生不定芽

或形成愈伤组织  再生苗

生根培养基

植 株

茎段培养过程示意图

取健壮茎段

去叶片后自来水冲洗

75%酒精1分钟

次氯酸钠5-10分钟0.1%升汞

MS培养

再生

注意事项:

嫩茎段常作为快速繁殖的外植体:即当年萌发或新抽出的尚未完全木质化的枝条,其细胞的可塑性大,容易离体培养。

体积小、不带叶原基的外植体培养难,成苗所需时间长,体积大的易于成功。

4、影响茎段芽增殖的因素

细胞分裂素和生长素的配比是关键!

其它因素的影响:如月季茎段增殖培养

1、腋芽在茎段上的位置。每段的一个腋芽培养在无激素的基本培养基上,23天后,靠近枝条两端的芽发育最慢,枝条中部的芽发育最快。

2、去除茎顶端的作用。继代培养接种时切去嫩茎的顶芽后,再转接于新鲜培养基上,能促进嫩茎的增殖。

3、嫩茎长度对形成多芽苗的影响。茎段为1-10 mm长短时,对形成多芽苗最有效,而且每个茎段的侧枝数也较多,若切割过短(小于1mm)或过长(11-15mm)都对茎的增殖不利。

三、植物叶培养

1、概念:以植物的叶器官(叶原基、叶柄、叶鞘、叶片、叶肉、子叶等)为外植体进行离体培养的技术。

2、用途:(1)研究叶形态发生过程;(2)研究光合作用、叶绿素形成;(3)研究遗传转化。

3、优点:(1)多数植物的叶片具有很强的再生能力;(2)数量多、取材方便。

4、叶培养的基本过程

取叶片

70%酒精浸泡30s

0.1%升汞浸泡数分钟

接种在固体培养基上

愈伤组织

胚 状 体

再生植株

多数情况下是这种途径

5、影响叶培养的因素

植物激素的种类和浓度是关键因素。

注:一般叶培养比茎段培养困难。

举例:非洲紫罗兰嫩叶离体培养的过程

叶片?诱导丛生芽?生根培养?移栽。

取嫩叶        70%酒精浸泡30s         0.1%升汞溶液消毒5-8 min          无菌水冲洗数次         切成0.5-1 cm的小块接种于MS 1 mg/L 6-BA 0.1 mg/L NAA固体培养基上       

        光照下培养,35天后叶片直接分化出丛生芽        小丛生芽转接于1/2  MS 0.2 mg/L IBA的培养基上,接种10天后,主茎叶片明显增大,根分化,15天后即可移栽。

第三节   植物繁殖器官培养

一、植物花器官培养

1、概念:对植物的整朵花或花的组成部分(花托、花柄、花瓣、花丝、子房、花药、胚珠等)进行离体培养的技术。子房、花药和胚珠以后章节叙述。

2、用途:用于性别决定、果实和种子发育、花形态发生的研究。

3、基本过程

花器官灭菌处理

适当切割

固体培养基培养

成熟果实 如人参、番茄、葡萄的花蕾培养

不定芽  如花椰菜的花托培养

或丛生芽或愈伤组织  如菊花的花托、花瓣培养

再生植株

二、植物幼果培养

1、概念:对植物不同发育时期的幼小果实进行离体培养的技术。

2、用途:用于果实发育、种子形成和发育等方面的研究。

3、培养过程:培养后直接得到的常是成熟果实或愈伤组织。

三、植物种子培养

1、概念:对受精后发育不全的未成熟种子进行离体培养的技术。

2、用途:①打破种子休眠,缩短生活周期;②挽救远缘杂种,提高杂种萌发率。

3、培养过程及特点:

培养的直接产物有:小植株,愈伤组织,丛生芽或不定芽。

种子培养要求糖浓度较低(1-3%),培养目的不同,培养基不同。

①成熟种子成苗:培养基简单,不加生长调节剂;

②未成熟种子成苗:培养基成分较全,需加生长调节剂;

③培养种子产生愈伤组织或不定芽:培养基成分、营养物质全面,添加不同种类、浓度的生长调节剂。

第四节   植物组织培养

离体植物组织培养对研究形态发生、器官发生、植株再生、植株脱毒、组织培养基础理论的建立等具有重要的作用,在整个离体培养研究中占有重要的地位。

植物组织培养

分生组织培养;

顶端分生组织(根尖、茎尖等)

形成层组织

愈伤组织培养;

薄层组织培养;对植物的薄细胞层进行离体培养的技术。如灭菌后的器官切取3-6层薄细胞层(如3-6层表皮细胞及表皮下细胞组成的薄层组织)

一、植物分生组织培养

分生组织培养的特点:生命力强;分裂能力持久;培养时易发生细胞分化再生植株;利于获得无病毒植株。

1、茎尖培养研究最为深入,广泛用于植株再生和脱病毒的研究及应用

2、茎尖培养可能发育的方向:(1)芽萌发(2)产生胚状体(3)产生不定器官(4)形成愈伤组织

3、影响发育方向的因素:(1)茎尖大小(用于脱毒的茎尖小,快繁的茎尖大)(2)培养条件(3)生长调节剂的种类和浓度

4、茎尖培养常用的培养基:MS培养基

5、注意事项:不得使用2,4-D,避免产生愈伤组织。

二、植物愈伤组织培养

愈伤组织培养的作用:1、研究脫分化、再分化、生长和发育、遗传变异、育种和次生代谢产物的生产等;2、是悬浮培养的细胞和原生质体的来源。

愈伤组织培养的条件:黑暗或弱光,25℃

三、植物薄层组织培养

薄层组织培养的作用:研究形态发生机理和影响因素及遗传变异产生的肌理。

思考题

1、根、茎、叶的培养过程

2、种子培养的用途及所用的培养基

第五章  植物胚胎培养和离体授粉

第一节  植物胚培养

一、胚培养的类型

成熟胚培养

幼胚培养:对培养条件要求较高

二、胚培养的用途

克服远缘杂交不亲和性(杂种胚夭折)

打破种子休眠,缩短育种周期

提高种子萌发率(有些种子不易萌发)

举例:一些园艺植物中,常有胚发育不良或中途败育现象,导致种子不能发芽。

(1)早熟桃,果实发育期短,胚发育不完全,种子发芽率低或不发芽,阴碍早熟桃的杂交育种; 

(2)兰花种子,由于缺乏胚乳,使种子无法单独萌发;

(3)在远缘杂交中,杂种的不亲和性,使种胚在发育过程中途败育等。

利用胚培养技术,可以分离发育不良种子或即将败育前的种胚进行培养,使胚继续发育至成熟,使杂交育种或远缘杂交获得成功,特别对于败育胚进行早早期离体培养,在遗传和育种上均具有重要意义。

三、幼胚培养方法

灭菌、幼胚分离、幼胚培养

以玉米幼胚培养为例

授粉后10-12天的幼胚,长约1-2.5mm, 70%酒精雌穗表面灭菌

切去籽粒顶部,用镊子取出幼胚。

盾片向上放在固体培养基上,一周后长出愈伤组织。常用培养基:MS,B5,White,N6

第二节  植物胚乳培养

一、概念

胚乳培养:将胚乳从母体上分离出来,放在无菌的人工环境条件下,让其进一步生长发育成幼苗的过程。

被子植物的胚乳是三倍体。

二、胚乳培养的意义

胚乳培养再生植株证明了全能性理论;研究胚和胚乳的关系及胚乳组织的功能;再生植株多为三倍体,产生无籽果实;可以从胚乳愈伤中分离和筛选各种类型的非整倍体植株。胚乳细胞是研究淀粉、蛋白质和脂类天然产物代谢途径的理想系统。

三、胚乳培养的方法

胚乳、愈伤组织、形态发生、胚状体发育成苗(柚,柑桔和枣)和不定芽苗(大麦, 水稻, 玉米, 苹果, 马铃薯)

四、需要说明的几个问题

1、胚乳培养绝大多数经历愈伤组织阶段,极少数从胚乳直接分化器官。

2、胚乳发育的时期对愈伤组织发育有影响

(1)发育早期的胚乳,接种不方便,愈伤组织的诱导频率很低;(2)处于旺盛生长期的胚乳,离体条件下最易诱导产生愈伤组织;(3)接近成熟或完全成熟的胚乳,愈伤组织诱导频率很低。

3、胚在胚乳培养中的作用

(1)旺盛期的未成熟胚乳,在诱导培养基上无需原胚的参与,就能形成愈伤组织;

(2)完全成熟的胚乳,生理活动很弱,在诱导脱分化前,必须借助于原胚的萌发,使其活化。(胚在萌发时产生某种物质“胚因子”。外源GA3能部分取代胚因子。)

4、胚乳再生植株的染色体倍性变异

胚乳愈伤组织及其再生植株的染色体数目常常发生变化,三

倍体细胞很少,同一植株往往是不同倍性细胞的嵌合体。

第三节  植物胚珠和子房培养

一、胚珠和子房培养的意义

1、防止杂种胚早期败育;2、未受精的胚珠培养能再生出单倍体植株,用于单倍体育种;3、是试管受精的基础。

二、胚珠和子房培养再生植株的染色体倍性

1、胚珠和子房中存在两种细胞:体细胞和性细胞(未受精时),所以再生植株可能来源于体细胞,也可能来源于性细胞,即再生植株可能是二倍体,也可能是单倍体;

2、若想通过胚珠和子房培养产生单倍体植株,就必须控制不同倍性组织中的细胞分裂。

第四节  植物离体授粉

一、概念

将未授粉的胚珠或子房从母体上分离下来,进行无菌培养,并以一定的方式授以无菌花粉,使之在试管内实现受精的技术,又称为离体受精或试管受精。

二、离体授粉的用途

克服受精前的障碍

克服花粉在柱头上不能萌发;花粉管在花柱中生长受阻或花柱太长;花粉管在花柱中破裂。

三、离体授粉的类型

离体柱头授粉、离体子房授粉、离体胚珠授粉

离体授粉还有许多问题需要研究,目前技术还不成熟。

第六章  植物花药和花粉培养

第一节  植物花药和花粉培养的应用

一、花药和花粉培养的概念

两者都是指在合成培养基上,改变花粉的发育途径,使其不形成配子,而像体细胞一样进行分裂、分化,发育成完整植株。两者的培养目的都一样,都是要诱导花粉细胞发育成单倍体植株。(花粉培养是将花粉从花药中游离出来进行培养)

二、花药和花粉培养的应用

1、诱导形成单倍体,通过染色体加倍,快速获得纯系,缩短育种周期;

2、根据单倍体材料,可以分析染色体组的构成,研究物种进化;

3、单倍体中每一种基因只有一个,便于研究基因的性质和作用;

4、有利于在细胞水平筛选隐性突变体,提高选择效率。

第二节  花药和花粉培养方法

一、花药培养

1、花药培养简史

1964年:Guha & Maheshwari南洋金花花药培养发育成胚; 1967年:Bourgin & Nitsch花药培养获得烟草植株; 1973年:我国首次报道了小麦花药培养获得再生植株;目前:许多农作物及经济植物通过花药培养都能诱导成植株。

2、花药培养技术

(1)取材时间

选择大致处于所需要时期的花蕾。由于花粉发育时期和植株的某些外部形态特征之间的大致相关性,因此利用这些外部标志,选择符合条件的花蕾,经镜检确定花粉发育的准确时期。

水稻,以单核靠边期的花粉对诱导单倍体植株较为适宜,在外部形态上可根据叶枕距为5-15cm,颖片淡黄绿色、雄蕊长度接近颖片长度的1/2这些条件鉴定。

烟草花药培养的最适取样期是花粉为单核期的花蕾,此时花蕾的花冠大约与萼片等长。

芦笋花药培养的最适取样期也是单核期的花粉,花蕾长为2-2.5mm。

注意:操作过程中不应使花药受到损伤,若受损伤,则应淘汰,因为损伤常常会刺激花药壁形成二倍体的愈伤组织。

(2)消毒方法

70%酒精浸泡花蕾30-60s

0.1%氯化汞3-10min或1%次氯酸钠10-20min

无菌水冲洗3-5次

接 种

二、花粉培养

1、花粉的分离

(1)自然散落法

花蕾消毒

取出花药

接种在培养基上

一段时间后,花粉囊自动裂开

收集花粉粒

新鲜培养基上培养

(2)挤压法
(3)机械游离法(搅拌法)
(4)过筛分离

2、花粉培养方式

(1)平板培养:固化培养基上培养,产生胚状体。
(2)液体培养:花粉悬浮在液体培养基上培养(摇床)。
(3)双层培养:花粉置在固体-液体双层培养基上。
(4)看护培养:用花药或花药产生的愈伤组织看护。
(5)微室培养:将花粉培养在很少的培养基中。
(6)条件培养基培养:在预先培养过花药的液体培养基中接入花粉进行培养。

三、影响花药花粉培养的主要因素

1、花粉发育时期是影响培养效果的重要因素

在离体培养中,对大多数植物来说,单核中期或晚期的花粉最容易形成花粉胚或花粉愈伤组织。

2、低温预处理可以提高花粉胚的诱导频率

各种植物要求预处理的温度和时间不同。

第三节  单倍体植株鉴定和染色体加倍

一、花药和花粉植株的倍性鉴定

1、染色体直接计数法:根尖、茎尖有丝分裂制片观察
2、细胞形态学鉴定法:保卫细胞的大小、单位面积上的气孔数与倍性有高度的正相关。
3、植株形态学的鉴定
4、扫描细胞光度仪鉴定:可测定叶片单个细胞核内的DNA含量,根据DNA曲线图推断细胞的倍性。

二、花药和花粉植株的染色体加倍

1、花粉植株染色体可自发加倍

2、人工加倍

(1)单倍体植株茎段培养在一定浓度的生长素和细胞分裂素的培养基上,产生的愈伤组织有大量的二倍体细胞,然后分化成苗。

(2)用秋水仙素浸泡再生植株或生长点或顶芽,或将单倍体植株的一部分作为外植体种植在含有秋水仙素的培养基中,培养一段时间,再转入无秋水仙素的培养基中继续培养。

禾本科植物的染色体加倍常用方法

------浸泡分蘖节法

助渗剂二甲基亚砜(1%-2%)的秋水仙素浸泡分蘖节。

在分蘖盛期,将花粉植株从土中挖出,洗净根部泥土,浸泡在秋水仙素溶液中,注意一定要将分蘖节浸入药液中。小麦一般采用0.04%秋水仙素溶液处理8h,水稻则用0.2%秋水仙素处理24h。

第七章  植物细胞培养

第一节  植物细胞培养

一、单细胞的分离

获得单细胞的途径

由完整的植物器官分离单细胞

由培养组织(如愈伤组织)中分离单细胞

1、由完整的植物器官分离单细胞

叶片是分离单细胞的最好材料

分离单细胞的方法:机械法 、酶解法

(1) 机械法

第一种方法:用刀片刮叶片

撕去下表皮,露出叶肉细胞

用解剖刀刮下细胞

液体培养基

第二种方法:叶片研碎、离心

加研磨介质研碎成粉

过滤、离心

液体培养基

说明:只有薄壁组织排列松散、细胞间接触面很小时,用机械法分离叶肉细胞才能取得成功。

(2) 酶解法

用果胶酶处理可以分离大量的叶肉细胞

切成小块

加果胶酶

过滤、离心

液体培养基

注意:大麦、小麦和玉米,很难通过酶解法使细胞分离。因为叶肉细胞较长,并在许多地方收缩,细胞间有链状互锁结构阻止细胞的分离。

机械法和酶解法比较

机械法:1、细胞不会受到酶的伤害; 2、质壁不会分离; 3、细胞产量低; 4、细胞易破坏。

酶解法:1、细胞会受到酶的伤害; 2、质壁可能分离; 3、细胞产量高; 4、细胞不易破坏。

2、由培养组织分离单细胞

茎段

诱导产生愈伤组织

反复继代,不断增殖,提高愈伤组织的松散性

将愈伤组织在液体培养基中培养,建立悬浮培养物

摇床振荡

二、细胞悬浮培养

悬浮培养:指将游离的植物细胞按一定的细胞密度,悬浮在液体培养基中进行培养的方法。

特点:1、细胞可以不断增殖,形成高密度的细胞群体,  适于大规模培养; 2、能够提供大量较为均匀一致的细胞,为研究细胞的生长、分化创造条件。

注:悬浮培养中既有单细胞,也有细胞团。

1、起始悬浮液的制备

愈伤组织

液体培养基

摇床振荡  转速30-150rpm 2-3cm冲程防细胞破裂

悬浮培养

要求:质地疏松,细胞分散程度大。(质地紧密,细胞分散程度小,不适于悬浮培养)

2、悬浮培养的基本形式

(1)分批培养

含义:将愈伤组织细胞分散在一定容积的密闭容器中进行培养,当培养物增加到一定量时,转接继代。它是进行细胞生长和细胞分裂的生理生化研究常用的培养方法。

常用的容器:三角瓶

继代方法:用注射器或移液管吸取一定量含单细胞和小细胞团的悬浮培养物,转移到含有新鲜培养基的培养瓶里,继续培养。

特点:培养基体积固定;培养过程中,因细胞生长,其数目不断发生变化,呈“S”形增长。;必须适当搅拌

细胞生长曲线

在整个培养过程中,细胞增值呈现出明显的由慢到快、再到慢,最后停止增长的细胞周期,即细胞的生长呈“S”形曲线

细胞生长各个时期的特点:

滞后期:细胞很少分裂,细胞数目不增加。

对数生长期:细胞分裂活跃,细胞数目迅速增加。

直线生长期:细胞生长、增值最快,单位时间内细胞数目增长大致恒定。

缓慢期:细胞增殖逐渐缓慢:培养液消耗将尽,有毒代谢物质增多,氧气减少等。

静止期:细胞生长几乎处于停止状态,细胞数目增加极少,甚至开始死亡。

说明:(1)滞后期的长短主要取决于继代时转入细胞所处的生长期和转入细胞数量。(2)加入条件培养基可以缩短滞后期。(条件培养基:曾培养过一段时间组织或细胞的培养基)(3)缩短两次继代时间间隔,可使悬浮培养的细胞一直保持对数生长期。(4)如果静止期时间过长,则会引起细胞的大量死亡和解体。

最佳继代时期:了解细胞数目增长变化“S”形曲线后,选择对数增长期、直线生长期进行继代。

操作注意事项:

对悬浮培养细胞继代时,进液口的孔径要小,只能通过单细胞或小细胞团(2-4个细胞)。常使用吸管或注射器。

继代前,培养容器静置一段时间,使大细胞团沉降后,再吸上层悬浮液。

照此多次继代后,可建立良好的细胞悬浮培养物。

(2)连续培养

利用特制的培养容器进行大规模细胞培养。分:开放式连续培养、封闭式连续培养

开放式和封闭式的区别

封闭式连续培养:排出的旧培养基由加入的等量新鲜培养基所补充,排出液中的细胞用机械方法收集后,又放入原培养系统,所以其培养细胞数目不断增加;

开放式连续培养:在注入等量新鲜培养基的同时,培养细胞随同培养液一起流出,培养细胞数目保持恒定;通过调节流入和流出的速度,使培养物的生长速度永远保持或接近最高值的恒定水平上。

三、单细胞培养

概念:对分离得到的单个细胞进行培养,诱导其分裂增殖,形成细胞团,再通过细胞分化形成芽、根等器官或胚状体,完成植株再生。

1、平板培养

(1)概念:将悬浮培养的细胞接种到未固化的琼脂培养基中,充分混合后,再倒入培养皿中进行薄层(1mm)培养的方法。是常用的单细胞培养法。

(2)用途:是为了分离单细胞无性系,研究其生理、生化的遗传上的差异而设计的一种单细胞培养技术。广泛应用于细胞、原生质体及融合产物的培养。

(3)基本技术

悬浮培养物(过滤)

一定密度的单细胞或小细胞团

0.6%-1%琼脂培养基灭菌

冷却到35℃(培养基没固化)

放入恒温水浴中

接种混合后

倒入培养皿中25℃暗培养

单细胞无性系

(4)特点:可以定点观察;容易分离单细胞系;培养细胞气体交换不畅。

(5)平板培养应注意的问题:(1)选用的培养基必须是能够在低的细胞起始密度下使细胞生长。(2)不要选用处在静止期过久的细胞。(3)在固体培养基中适宜的起始密度因植物种类而不同。如:烟草细胞适宜的为5-10 ?0 个/ml。(4)接种时固体培养基的温度要严格控制,一般不超过35 ℃,温度低对细胞伤害小,但操作困难,凝固快会造成细胞分布不均。

2、看护培养

(1)概念:用同种或异种材料的愈伤组织作为看护组织来培养细胞的一种方法。就是把单细胞放在一块活跃生长的愈伤组织上进行培养,在愈伤组织和培养的细胞之间有一层滤纸相隔。

(2)基本过程

愈伤组织和单细胞可以是相同种或不同种

具体过程描述

在一个培养瓶中加入一定量厚的固体培养基,灭菌后备用。

在无菌条件下,先将一小块(1cm)活跃生长的愈伤组织接种到培养基上,再在愈伤组织块上放一片(1cm玻┮衙鹁穆酥剑缓蠓胖靡桓鐾砩稀

将分离出的单个细胞接种到培养基的滤纸上。

恒温培养。

(3)特点:效果好,易于成功; 简便易行。

离体单细胞在直接培养技术下不分裂,看护培养下则分裂的原因:看护愈伤组织给单细胞提供了培养基的营养成分和促进细胞分裂的其它活性物质。

3、微室培养

(1)概念:将细胞放在人工制造的一个小室中进行培养。

(2)基本过程:(3)微室培养特点:在培养过程中可以连续进行显微观察,将一个细胞的生长、分裂和形成细胞团的全部过程记录下来。

(4)微室培养要求:

 微室内不能有气泡。

 微室的厚度最好不要超过20微米,盖玻片的厚度要在0.17-0.18mm左右。

 观察时要保持温度和培养时一致。

4、条件培养基培养

在培养基中加入高密度的细胞进行液体培养,一定时间后这些细胞就会向培养基中分泌一些物质,过滤掉其中的细胞,将这种这种培养基再制成液体或固体培养基来培养单细胞或细胞团,这样可明显提高单细胞培养物的存活和分裂的能力。

5、液体浅层培养

将悬浮培养液中的细胞过滤,得到游离单细胞和小细胞团

在浅层液体培养基中培养

用途:主要用来增殖细胞。

特点:有利于有毒物质的扩散;有利于气体交换;不利于定点观察;单细胞生长、分裂后,难以得到单  细胞系。

四 、影响细胞培养的因素

1、培养基

适合愈伤组织的培养基不一定适合悬浮细胞培养;当能诱发愈伤组织产生的培养基可以进行悬浮细胞培养;

尽量选择使细胞容易分离的培养基。如N6、MS、B5培养基适合单子叶细胞悬浮培养,MS、B5、LS等适合双子叶细胞悬浮培养;

悬浮培养常需要加水解酪蛋白、脯氨酸等物质;需要更高的硝态氮和氨态氮;

条件培养基更适合单细胞培养和低密度细胞培养。

2、细胞密度

细胞密度:单位体积内的细胞数目,常以每毫升培养液中含有的细胞数目表示。

单细胞培养时,起始密度低于某值时,培养的细胞就不能分裂和发育成细胞团,称该值为临界密度。一般单细胞培养时的起始密度越高,越容易诱导细胞的分裂。

3、植物生长调节剂

不同的激素对细胞的分散性不同;

生长素和细胞分裂素的配比影响细胞聚集性;

在培养基中加入2,4-D、少量水解酶(纤维素酶、果胶酶)能够增加细胞的分散性。

4、pH

常用的培养基缓冲能力很弱,不适合细胞悬浮培养,悬浮培养时pH有相当大的变动,所以需加入缓冲物(如磷酸钙、碳酸钙等)来稳定培养液的pH值。

第二节  植物细胞培养的应用

一、植物次生代谢产物的生产

1、生产天然的植物成分

细胞培养的分泌物成分有时是植物自然合成的好几倍。

2、生物转化

给细胞提供在一般情况下植物所不具备的底物化合物,转化(合成)出自然界所不存在的化合物;

给细胞提供植物天然产物中间体,提高该种化合物在细胞中的产量。

二、突变体选择

细胞突变频率高,突变范围广,再生植物一般不是嵌合体。分为直接选择和间接选择。

三、诱导多倍体

细胞培养中常出现染色体自然加倍现象;也可使单倍体再生植株人工加倍。在遗传育种上有重要意义。

第三节  人工种子

1、概念:指离体条件下的植物材料,通过繁殖获得大量的高质量的成熟胚状体,把这些胚状体外面包上有机化合物作为保护胚状体和提供营养的“种皮”,从而创造出类似于真种子的结构。人工种子包括体细胞胚、人工胚乳和人工种皮三部分。

2、优点:(1)繁殖速度快;(2)快繁和保存自然条件下不易结实或种子昂贵的材料;(3)固定杂种优势;(4)基因工程的细胞通过胚状体应用于生产;(5)人工种子制作中可加入各种营养成分和调节剂,提高植物抗逆性;(6)节约土地、节约粮食。

思考题

1、如何获得单细胞?

2、什么是细胞的悬浮培养?

3、单细胞培养有哪些方法?

4、影响细胞培养主要有哪些因素?

第八章  植物原生质体培养

原生质体:指脱去植物细胞壁后裸露的、有生活力的原生质团。和植物正常细胞相比,除了没有细胞壁外,具有活细胞的一切特征。

原生质体培养的意义

植物原生质体培养和细胞融合是植物细胞工程的核心技术,尤其在克服远缘杂交不亲和性、创造种质资源方面发挥了重要作用;

植物原生质体比较容易摄取外来遗传物质,是遗传转化的理想受体,为细胞水平、分子水平上的遗传操作提供了理想的实验体系;

为细胞生物学、植物生理学和体细胞遗传学的发展做出了重要贡献。

一、原生质体的分离

1、植物细胞膜和细胞壁的构成:

细胞膜:脂类、蛋白质

细胞壁:初生壁(纤维素、半纤维素、果胶、少量结构蛋白)、次生壁(纤维素、半纤维素)

两个相邻细胞的初生壁之间有胞间层。

2、供体材料

供体材料是影响原生质体培养能否成功的关键。理论上植物的各种器官、组织和细胞都可作为分离原生质体的供体材料,但目前常用叶片、分裂旺盛和再生能力强的愈伤组织及悬浮细胞系,尤其是胚性愈伤组织或胚性悬浮细胞系是最理想的原生质体分离材料。

3、原生质体的分离方法

首先对外植体进行预处理,有两种方法:

低温处理:外植体放在4℃下,黑暗中1-2天。等渗溶液处理:外植体放在等渗溶液中数小时。

(1)机械分离法

步骤:使细胞质壁分离→切开细胞壁→获得原生质体。

缺点:原生质体产量低,液泡化程度低的细胞也不能采用此方法。

目前,该方法没有得到广泛应用。

(2)酶分离法

两步法:果胶酶处理材料、游离出单细胞、纤维素酶处理单细胞、分离出原生质体

优点:所获得的原生质体均匀一致、质量好;

缺点:操作复杂,已被淘汰。

一步法:外植体、酶液配制:注意纤维素酶、果胶酶和渗透压稳定剂(甘露醇)的配比及pH、酶液离心

过滤灭菌后-20℃保存、外植体放入酶液,真空泵抽引渗透处理、26℃摇床振荡2-8小时

二、原生质体的纯化

纯化原因:上述酶处理后的混合物含有:未消化组织、破碎细胞和原生质体。所以,必须对得到的混合液体进行纯化,以得到纯净的原生质体。

纯化方法:沉降法、漂浮法、不连续梯度离心法

1、沉降法

微孔滤膜过滤酶混合(液除去未消化的组织细胞)

低速离心3-5min

弃去上清液和酶液(使原生质体沉淀)

液体培养基或甘露醇悬浮洗涤原生质体2-3次

将原生质体悬浮在液体培养基中备用

沉降法的优点:纯化收集方便,原生质体丢失少;目前被广泛采用。
缺点:原生质体纯度不高。

2、漂浮法                            

原理:原生质体和细胞、细胞碎片的比重不同。原生质体比重小,在较高浓度的溶液中将漂浮在上面。

无菌下,浓度较高溶液(如20%蔗糖溶液)加入离心管

加入原生质体混合液

封口后,离心,原生质体漂浮在上面

用吸管收集原生质体液面,放入液体培养基或甘露醇悬浮洗涤原生质体2-3次

将原生质体悬浮在液体培养基中备用

漂浮法的优点:原生质体纯度高。

缺点:原生质体收率低。

3、不连续梯度法                             

离心管中配制成不同的浓度梯度

加入原生质体混合液

离心5min,原生质体位于某一浓度梯度,用吸管收集

液体培养基或甘露醇悬浮洗涤原生质体2-3次

将原生质体悬浮在液体培养基中备用

优点:获得的原生质体大小均匀一致,纯度高;
缺点:操作繁琐,原生质体收率低。

三、原生质体的培养方法

暗培养:

平板培养法

液体浅层培养法

固-液结合培养法

四、影响原生质体培养的因素

原生质体活力

原生质体起始密度:过低过高均不利

渗透压稳定剂:常用甘露醇

培养基成分

培养条件:初期培养是暗培养

植物种类

基因型

五、原生质体再生

1、细胞壁再生:原生质体培养后1-2天即可合成完整细胞壁,只有形成完整细胞壁的细胞才能进入细胞分裂。

2、细胞分裂、愈伤组织或胚状体形成

3、植株再生途径:(1)通过愈伤组织形成不定芽;该途径占多数。(2)原生质体再生细胞直接形成胚状体。

第九章  植物体细胞无性系变异

一、体细胞无性系变异的概念

1、概念:培养物在培养阶段发生变异,导致再生植株也发生遗传改变的现象。胚胎发生和器官发生途径都会出现这种现象。

2、变异种类:(1)形态特征(2)生长习性(3)抗性:抗病性,抗逆性(4)染色体数目变异(5)染色体结构变异

二、体细胞无性系变异体的筛选

1、起始材料的选择

外植体产生的愈伤组织或单细胞悬浮培养物或原生质体均可作为变异体筛选的起始材料。

2、突变细胞的选择

(1)直接选择法:向培养基中直接加入选择剂(除草剂、盐类、重金属等),通过多次继代筛选变异体。

(2)间接选择法:向培养基中不直接加入选择剂,而是加入选择剂的替代物质进行变异体选择的方法。该方法适用于难于或不能用直接选择法分离变体体的情况。

如:在培养细胞中直接选择抗旱的材料,实践证明是有困难的,这样通过选择抗羟基脯氨酸类似物的变异体,从而间接筛选出抗旱变异体。因为生理研究发现,抗羟基脯氨酸类似物的变异体可以合成脯氨酸,脯氨酸在植物体内的累积是植物适应干旱的一种反应。

另外:在继代中可以采用逐步提高筛选压力法,也可以采用同样筛选压力下多次继代法。

3、变异性状的稳定性鉴定

鉴定原因:选择培养基上存活的细胞并非都是突变细胞;体细胞无性系变异并非都可以稳定遗传。

鉴定方法:(1)选择出来的细胞或组织放在正常培养基继代几次,仍表现变异性状者为突变体;(2)再生植株水平鉴定;(3)再生植株后代鉴定。

植株水平鉴定可以进行形态、生理生化鉴定,也可以进行DNA水平、RNA水平和蛋白质水平鉴定。

三、影响体细胞无性系变异的因素

不同物种、不同基因型材料变异频率不同

外植体类型和生理状态

同一种植物不同的外植体变异频率不同;特异化程度高或衰老的组织变异频率高;

培养基:培养基中的有些物质尤其是生长调节剂可能就是诱变因素。

继代培养时间:时间越长,变异频率越高,再生能力越低。 

四、体细胞无性系变异的机理

预先存在的变异表达

染色体数目变化:细胞分裂不正常

点突变:碱基变化导致基因突变

体细胞染色体不正常交换:非同源染色体间的交换,姊妹染色单体的不对称交换,引起染色体结构变异。

逆境下DNA序列的增加或缺失导致蛋白质变化

转座子的活化使靶点处的基因失活或造成基因重排。

DNA甲基化状态的改变改变基因的活性。DNA甲基化程度高,基因的活性被抑制,甲基化程度低,基因的活性被提高。组织培养中也可能使DNA去甲基化。

细胞质DNA的改变。

外部环境影响基因的表达。

五、体细胞无性系变异的应用

改良作物品种个别缺点,简便快速

利用丰富变异,拓宽种质资源

离体培养远缘杂种,利用组培过程中非同源染色体的联会和交换,实现野生种的染色体片断向栽培种的导入。

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